ESTUDO DOS COMPONENTES DA MAQUINARIA EPIGENÉTICA EM SCHISTOSOMA MANSONI |
A esquistossomose é uma doença endêmica nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, estima-se que aproximadamente 200 milhões de pessoas estejam infectadas. O Schistosoma mansoni , parasita causador dessa doença, apresenta desenvolvimento intrigante e apesar de vários esforços para caracterizar os genes, transcritos e o epigenoma do parasita, ainda não está totalmente esclarecido como a expressão gênica é regulada no ciclo e sobre os aspectos da maquinaria envolvida. Desta forma, os nossos objetivos são investigar a transcrição das enzimas modificadoras no ciclo do parasita e determinar as proteínas histonas constituintes do nucleossomo do S. mansoni . Inicialmente realizamos uma busca nos bancos de dados (GeneBD e NCBI) das entradas para os genes que codificam as enzimas modificadoras de histonas (acetilases, deacetilases, metiltransferases e demetilases), para o desenho dos oligonucleotídeos específicos para os 55 genes depositados. Os oligonucleotídeos foram desenhados utilizando o algoritmo Primer 3, a partir dos transcritos depositados no Gene DB. Utilizamos a temperatura de anelamento de 60°C e conteúdo de GC 50% e delimitamos o tamanho dos transcritos de 80 a 120 pb. Para determinar a eficiência dos oligonucleotídeos utilizamos DNA genômico do parasita em diferentes concentrações e estes amplificaram com uma eficiência de ±2 Cts em relação ao gene endógeno SmEIF4E (Smp_001500). Para determinar a transcrição extraímos o RNA e sintetizamos o cDNA de cercarias, esquitossômulos em cultura de 24 horas, 3, 5 e 7 dias e vermes adultos perfundidos em 3, 5 e 7 semanas. Os resultados iniciais de qRT-PCR indicam que para cercaria, esquitossômulo de 24 horas e 5 dias ocorre um aumento no número de transcritos expressos, quando comparado com cercaria, sugerindo uma expressão diferencial. Também avaliamos o perfil das histonas estruturais dos nucleossomos do parasita, através da extração de histonas ácidas, digestão por tripsina e análise de 3ug desse extrato no espectrômetro de massas LC-MS/MS qTOF-Ultima (Waters). A identificação dos espectros de massa foi realizada utilizando o programa MASCOT. Paralelamente, o mesmo extrato foi analisado por SDS-PAGE, para comparação dos perfis eletroforético e espectrometria de massas. Os nossos resultados sugerem que o parasita apresenta uma constituição de nucleossomo conservado, apresentando as histonas H2A, H2B, H3, H1 e H4, sugerindo a presença de uma maquinaria própria relacionada com a regulação epigenética. |