PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE RT-PCR, DUPLEX, MULTIPLEX e NESTED EM TUBO ÚNICO PARA DETECÇÃO DO VÍRUS ZIKA, DENGUE E CHIKUNGUNYA. |
Os vírus zika (ZIKV), dengue (DENV) e chikungunya (CHIKV) são as arboviroses mais prevalentes na América, com o mesmo o mosquito Aedes aegypti , se sobrepõem em áreas endêmicas e possuem sintomas clínicos semelhantes, especialmente nos estágios iniciais da doença, são consideradas como um grande problema de saúde pública em áreas endêmicas, com necessidade de testes laboratoriais para confirmar a infecção por essas viroses. Esses testes devem ser rápidos, específicos, eficientes, econômicos e fáceis de serem realizados, permitindo que possa ser feita a identificação dos vírus nos pacientes que apresentarem os sintomas da doença. Com o objetivo de desenvolver o diagnóstico molecular para a identificação dos gêneros Alphavirus e Flavivirus , com detecção simultânea dos vírus ZIKV, DENV e CHIKV em uma única reação e diferenciação dos sorotipos do vírus dengue, foram utilizados nove pares de oligonucleotídeos iniciadores já descritos na literatura que se mostraram sensíveis e específicos para amplificarem a sequência alvo dos vírus. Três modalidades diferentes da RT-PCR foram utilizadas para atingir este propósito, a RT-PCR Duplex , a RT-PCR Multiplex e a Nested RT-PCR. Como resulados, todos os oligonucleotídeos iniciadores foram capazes de amplificar a região alvo quando em reação isolada, contudo, quando analisados em conjunto na reação RT-PCR Duplex foi possível observar apenas o produto amplificado pelo par de oligonucleotídeos iniciadores FG1/FG2, mostrando que o par de oligonucleotídeos iniciadores cM3W/M2W não foi capaz de amplificar a região alvo. Na reação RT-PCR Multiplex , foi possível observar apenas os produtos amplificados pelos oligonucleotíeos iniciaadores DEN-F/DEN-CR e ZIKVEN-F/ZIKVEN-R, porém não foi possível observar o produto do oligonucleotídeo iniciador CHIKF/CHIKR, no entanto, quando a reação foi realizada separadamente foi possível observar todos os produtos amplificados por cada um dos oligonucleotídeos iniciadores. Na reação Nested RT-PCR, foi possível observar apenas os produtos amplificados pelos oligonucleotídeos iniciadores DEN-F/DEN-CR, DEN-1 e DEN-2. Esses resultados mostram que ainda é necessário a otimização dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das reações para aumentar a sensibilidade dos testes realizados neste estudo para que se possa padronizar um teste para a detecção das simultaneamente na mesma em uma reação de tubo único as arboviroses aqui descritas. |