AVALIAÇÃO DE TÉCNICAS PARA OBTENÇÃO DE DNA EM SANGUE PERIFÉRICO PARA DETECÇÃO DE Leishmania POR PCR |
As leishmanioses são doenças antropozoonóticas com alto impacto na saúde pública, sendo estimado pela OMS que pelo menos 350 milhões de pessoas estão expostas à infecção e que existem até 2 milhões de novos casos anualmente. Essas doenças se manifestam de duas formas: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT). A LV caracteriza-se por um acometimento de baço, fígado e linfonodos, enquanto a LT manifesta-se em lesões de pele e mucosas. Existem várias amostras clínicas que podem ser utilizadas no diagnóstico das leishmanioses, sendo o sangue periférico uma das principais. Diversas técnicas para detecção do parasito são descritas, sendo a Reação em Cadeia Polimerase (PCR) altamente recomendada devido à alta sensibilidade e especificidade. Para a realização da PCR podem ser usadas diversas técnicas de obtenção do DNA das células sanguíneas, o que pode influenciar na eficácia da PCR. O objetivo do presente trabalho foi verificar a efetividade de duas diferentes técnicas de obtenção de DNA de sangue periférico: com Duodecil Sulfato de Sódio 20% (SDS) e com Guanidina-Fenol (GT ). Para isso, foram utilizadas 30 amostras de sangue periférico de humanos sadios, acrescidas de 10 4 promastigotas de Leishmania infantum . O DNA obtido foi quantificado em Biodrop®. Após a obtenção e quantificação de DNA, foi realizada a PCR com os iniciadores 13A/13B para detecção de Leishmania spp., e o produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 2%. Os resultados mostraram que a técnica com GT apresentou maior rendimento de DNA, porém as razões A260/230 e A260/280 foi inferior do que a técnica com SDS. Após a eletroforese, as bandas obtidas pelas duas técnicas ficaram bem definidas porém as bandas com GT foram mais destacadas. Em relação ao custo-benefício e o tempo de execução, a técnica com SDS foi melhor e mais rápida. Concluímos que ambas as técnicas foram efetivas para obtenção de DNA, porém, levando em consideração o grau de pureza, custo-benefício e rapidez, a técnica com SDS apresentou melhor desempenho. |