AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS ALTERNATIVOS DE EMBLOCADOS CELULARES PARA FUNGOS COM APLICAÇÃO EM MÉTODOS BIOMOLECULARES |
Os métodos de emblocados celulares (EBs) são utilizados tanto em rotina quanto em pesquisa, pois preservam o material celular permitindo que técnicas complementares sejam executadas, contribuindo para o diagnóstico laboratorial. O objetivo deste trabalho foi avaliar três diferentes protocolos de EBs para Aspergillus fumigatus por meio das técnicas de PCR e hibridização in situ (ISH). Para a confecção do EB, culturas de A. fumigatus foram fixadas com formalina 10% (24h) e álcool 70% (3h). Após a fixação, o sobrenadante foi descartado e o pellet misturado com tecido humano normal (baço, fígado e coração), seguindo três protocolos diferentes: aplicação de Histogel, agarose 2% com glicerol ou 3 gotas de Solução de Nathan com eosina ( overnight ). O material foi envolto em um papel de seda, colocado em cassete histológico e seguiu o processamento histológico e microtomia (ISH: corte de 3µM em lâmina silanizada; PCR: 2 fitas de 5µM em microtubo estéril). A ISH foi realizada com o kit da Zytofast Plus Cish Implementation Kit–HRP–DAB e para a detecção de Aspergillus spp . utilizamos o pool de duas sondas (5'- TCC ACA CCC TAT GGT CGT ATG T-3'[Dig] e 5'-GTA CGG CTG AGC GGA CGG GAA-3'[Dig]). Para a PCR, foi utilizado o iniciador para o gene endógeno humano 18S (controle) e os iniciadores panfungo NL1/NL4 e ITS1/ITS4. A ISH foi positiva para os três protocolos testados. Houve amplificação para o gene 18S nos três protocolos. Para os iniciadores NL1/NL4, a banda amplificada do EB com Histogel apresentou maior intensidade no gel de eletroforese. Os EBs com Histogel e agarose apresentaram banda fraca para os iniciadores ITS1/ITS4. Não foram obtidos amplificados com NL1/NL4 e ITS1/ITS4 nas amostras fixadas em Solução de Nathan. Embora o Histogel seja amplamente utilizado na confecção de EBs, seu alto custo pode inviabilizar sua aquisição. Os diferentes protocolos testados não alteraram os resultados da ISH. Entretanto, o uso de Solução de Nathan se mostrou inadequado para a amplificação de sequências de DNA específicas. A agarose mostrou resultado inferior, ainda que positivo, na detecção de fungos quando comparado ao Histogel. Deste modo, agarose pode ser viável como protocolo alternativo ao Histogel na confecção de EBs para aplicação em hibridização in situ e PCR. |