PADRONIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE qPCR SYBR GREEN KDNA PARA O DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
DANIEL MOREIRA DE AVELAR ¹
1. IRR/FIOCRUZ - Instituto René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz
DANIEL.AVELAR@MINAS.FIOCRUZ.BR

Introdução : Os métodos moleculares apresentam-se como importantes ferramentas para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana ( LTA) por sua alta acurácia, rapidez e confiabilidade. Esse estudo propôs o desenvolvimento e a avaliação de um ensaio de qPCR SYBR GREEN kDNA para o diagnóstico das formas cutânea (LC) e mucosa (LM) de LTA. Desenho do estudo: O estudo foi do tipo retrospectivo, fase II, utilizando amostras de DNA total extraído de fragmentos de biópsia de pele ou mucosa, com cálculo amostral mínimo de 80 casos (LC e LM) e 80 não-casos de LTA. Material e métodos : A padronização do ensaio qPCR SYBR GREEN kDNA foi realizada utilizando os iniciadores que amplificam um fragmento de 120pb. As melhores condições foram otimizadas a partir de testes com diferentes concentrações dos reagentes utilizados. Também foram avaliados os parâmetros de sensibilidade e especificidade analíticas, repetibilidade e reprodutibilidade. A acurácia diagnóstica do ensaio de qPCR foi realizada no Instituto René Rachou/FIOCRUZ-MG. Resultados : O teste de sensibilidade analítica demonstrou amplificação até a diluição de 0,1fg e 1 parasito/mL de sangue utilizando DNA de Leishmania amazonensis, L. braziliensis e L. guyannensis . Em relação à especificidade analítica, foi verificada apenas a amplificação do DNA de Leishmania sp., com resultados negativos para Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, P. vivax e Sporothrix sp. Os testes de repetibilidade e reprodutibilidade demonstraram 100% de concordância. Até o presente momento foram realizados testes em 118 amostras de casos (92 de LC e 26 de LM) e 80 não casos de LTA (68 casos suspeitos de LC e 12 casos suspeitos de LM, mas todos negativos para LTA). O ensaio de qPCR SYBR GREEN kDNA apresentou sensibilidade de 100% (IC 95%:96,9-100% ) e especificidade de 98,8% (IC 95%: 93,2-99,9%), com acurácia de 99,5% (IC95%: 97,2-99,9%). A análise por forma clínica de LTA demonstrou os seguintes resultados para LC e LM, respectivamente: 100% (IC95%: 96,1-100%) e 100% (IC95%:86,8-100%) de sensibilidade, e 98,5% (IC95%: 92,1-99,9%) e 100% (IC95%: 73,5-100%) de especificidade. Conclusão : O ensaio de qPCR SYBR GREEN kDNA demonstrou alta acurácia apresentado-se como um diagnóstico sensível e específico para o esclarecimento dos casos suspeitos de LTA.