AVALIAÇÃO DE PERFORMANCES ANALÍTICA E CLÍNICA DE ENSAIOS DE PCR EM TEMPO REAL PARA A DETERMINAÇÃO DE CARGA PARASITÁRIA EM LEISHMANIOSE CUTÂNEA NAS AMÉRICAS |
De acordo com OPAS/OMS, estima-se que 12690 novos casos de Leishmaniose Cutânea (LC) tenham sido relatados no Brasil em 2016, o que representa 94% do total de casos. Embora exista um grande número de metodologias e alvos empregados para o diagnóstico molecular da doença, a ausência de um consenso dificulta a comparação de resultados entre diferentes laboratórios. Assim, a padronização e validação multicêntrica de um protocolo consenso representaria uma grande contribuição para a área. Neste sentido, o projeto visa realizar a padronização e validação multicêntrica de uma metodologia baseada em PCR em tempo real para LC nas Américas. Para a validação analítica, o DNA de cepas de referência de diferentes espécies de Leishmania foi extraído utilizando o High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche). Para o controle de qualidade da extração de DNA e PCR em tempo real, foi utilizado o kit TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (Exo-IPC, Applied Biosystems). A carga parasitária foi estimada através de ensaios TaqMan, com um alvo no parasito (18S ssrDNA, kDNA ou HSP70 (FAM/NFQ-MGB)) em multiplex com o alvo RNAse P humano (VIC/TAMRA), previamente desenvolvidos pelo nosso grupo. Inicialmente, diferentes tampões para o armazenamento das amostras, desde o momento da coleta até a análise molecular, foram comparados: RNAlater (Invitrogen), Tissue Lysis Buffer (Roche) e Guanidina 6M-EDTA 0,2M. Observamos que o Tissue Lysis Buffer apresentou melhores resultados, representados por menores valores de Ct na detecção do parasito. Em seguida, os 3 ensaios multiplex foram comparados, utilizando DNAs extraídos de 10 6 parasitos/mL. Verificamos que, entre as especies avaliadas, o ssrDNA, kDNA e HSP70 apresentaram Cts médios (±desvio padrão) 17,03±0,62, 19,08±5,85 e 23,09±0,73, respectivamente. O alvo ssrDNA foi o que apresentou menores Ct médio e desvio padrão entre as espécies testadas. Em contrapartida, o alvo kDNA foi o que apresentou maior variação entre as especies. Em seguida, foi realizada a análise de extensão dinâmica, onde o ensaio para o kDNA apresentou a melhor linearidade: de 10 6 a 10 -2 eq. Parasitos/mL. Ao concluir todos os ensaios previstos na validação analítica, pretendemos selecionar o alvo que apresentou a melhor performance, para seguir com a validação clínica multicêntrica, em parceria com a OPAS, utilizando amostras de pacientes com LC provenientes de diferentes países endêmicos nas Américas. |