APLICAÇÃO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA ESTUDO DA VIABILIDADE DE TRYPANOSOMA CRUZI NA INTERAÇÃO COM RHODNIUS PROLIXUS
PAULA FINAMORE ARAUJO 1, CECILIA VIEIRA1, DANIELE CASTRO1, PATRÍCIA AZAMBUJA1, CONSTANÇA BRITTO1, OTACILIO DA CRUZ MOREIRA1
1. FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz, 2. FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
paulafinamore@gmail.com

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e consiste em um grande problema socioeconômico em diversos países da América Latina. A utilização de técnicas moleculares para a detecção de DNA de T. cruzi em triatomíneos já vem sendo descrita na literatura por alguns autores, que mostram que esta técnica apresenta maior sensibilidade na detecção do parasito, em comparação com o método clássico de análise, a microscopia óptica. Previamente, desenvolvemos e validamos uma qPCR multiplex , sistema TaqMan, com alvos para o gene correspondente à região 12S do RNA ribossomal de triatomíneos e para o DNA nuclear satélite de T. cruzi, onde foi possível estimar a carga parasitária em amostras de insetos de campo naturalmente infectados por T. cruzi . Entretanto, uma questão recorrente em relação à detecção de T. cruzi em insetos, utilizando DNA como alvo molecular, está relacionada com a possibilidade de não diferenciação entre parasitos viáveis ou mortos. A molécula de RNA, por ser mais lábil, vem sendo utilizada como marcador de viabilidade em outros modelos de interação patógeno-hospedeiro. Portanto, em paralelo à qPCR multiplex, foi padronizada uma metodologia baseada em RT-qPCR para quantificar formas viáveis dos parasitos em amostras de triatomíneos, com alvo no gene GAPDH, que é expresso constitutivamente em todas as formas evolutivas do parasito. Para comparar as duas metodologias na avaliação da infecção de T. cruzi no triatomíneo, Rhodnius prolixus foram infectados com formas epimastigotas do parasito e foi quantificada a carga parasitária ao longo de todo o trato digestivo, extraindo RNA e DNA total destes insetos em diferentes períodos após a alimentação. Com isso, foi observado que, a partir de 9 dias pós-alimentação dos insetos, ocorre uma d iminuição da quantidade de parasitas detectados por RNAm em todo o trato digestivo do vetor (1,2x10 6 para 1,4x10 5 equivalentes de parasita/eq. de triatomíneo), que não é acompanhada da mesma forma pela diminuição da quantidade de parasitos totais detectados por DNA (1,3x10 6 para 5,4x10 5 eq. par./eq. triat.). Ao avaliar separadamente o conteúdo intestinal, por RT-qPCR, foi observado que esta diminuição ocorre, principalmente, na porção anterior do intestino médio destes insetos. Os ensaios moleculares desenvolvidos neste estudo possuem potencial para contribuir na determinação da taxa de infecção de triatomíneos silvestres, em estudos sobre competência vetorial de triatomíneos e a incidência da doença de Chagas.



Palavras-chaves:  Doença de Chagas, qPCR, Rhodnius prolixus, RT-qPCR, Trypanosoma cruzi