UMA NOVA LINHAGEM REPORTER DE Trypanosoma brucei PARA ESTUDOS COM INIBIDORES DE PROTEASSOMO |
Espécies patogênicas do gênero Trypanosoma , como o T. brucei e T. cruzi, são agentes etiológicos de doenças negligenciadas, que podem ser fatais se não tratadas. O proteassomo é um complexo multicatalítico, que desempenha um papel central em todos os organismos eucarióticos, regulando a função de múltiplos alvos, incluindo proteínas citosólicas, nucleares e de membrana. Devido a isso, o sistema ubiquitina-proteassomo tem sido apontado como um alvo terapêutico para diversas patologias. Os inibidores desta via são estruturalmente diversos e podem interagir direta ou alostericamente com o sítio ativo, de maneira reversível ou irreversível. A lactacistina é um inibidor específico amplamente utilizado e mostrou-se capaz de inibir a atividade do proteassomo tanto em T. brucei quanto em T. cruzi . Mais recentemente, foram descritos novos inibidores seletivos do proteassomo de tripanosomatídeos com eficácia in vivo, apontando esta via como um alvo potencial para o tratamento de infecções causadas por parasitas. Apesar da ação inibitória da lactacistina em espécies de Trypanosoma já ser conhecida, a maioria dos estudos utiliza tratamentos por longos períodos, conforme estabelecido para a maioria dos tipos de células de mamíferos. No entanto, esses longos períodos de incubação podem ser críticos em experimentos que visam identificar a resposta precoce da inibição do proteassomo, pois podem levar a efeitos não específicos causados por danos acumulados, que geralmente causam a inibição do crescimento celular. Neste trabalho, descrevemos uma nova linhagem de T. brucei que expressa uma proteína verde fluorescente (GFP) marcada com ubiquitina, responsiva ao tratamento com lactacistina. Uma construção plasmidial foi gerada para permitir a expressão constitutiva de uma versão modificada da ubiquitina, incapaz de ser reconhecida por deubiquitinases (UbG76V), e fusionada à GFP em células procíclicas de T. brucei . Em condições normais, esta proteína quimérica é endereçada à degradação e não é detectada, entretanto, após tratamento com lactacistina a 5 m M, o acúmulo de GFP pode ser facilmente observado já nas primeiras horas, através de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Assim, esta linhagem pode ser amplamente utilizada para monitorar a eficiência do tratamento de inibidores em estudos envolvendo proteólise ou outros eventos relacionados com a via da ubiquitina-proteassomo, além de permitir uma triagem mais prática de novos inibidores desta via. |