MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO DE NEUTRÓFILOS HUMANOS INDUZIDOS PELA L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE Calloselasma rhodostoma |
Os venenos de serpentes são constituídos principalmente por proteínas e peptídeos, tornando essas moléculas interessantes para a pesquisa de toxinas animais na ciência biomédica. Dentre esses componentes, as proteínas L-aminoácido oxidases (LAAOs) possuem atividades antimicrobianas em bactérias, fungos, vírus e parasitas, induzem edema, possuem efeitos citotóxicos, coagulantes e anticoagulantes, hemorrágicos e ativam neutrófilos. Ao entrar em contato com o patógeno, o neutrófilo realiza a fagocitose e libera espécies reativas do oxigênio (EROs) via ativação do complexo da NADPH oxidase associado à ativação da PKC. O complexo da NADPH oxidase é composto por proteínas citosólicas (p40 phox , p47 phox e p67 phox ), proteínas de membrana (p22 phox e gp91 phox ) e por uma proteína de sinalização (Rac). O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da LAAO de Calloselasma rhodostoma sobre a ativação do complexo da NADPH oxidase de neutrófilos humanos. Os neutrófilos isolados foram incubados com tampão-fosfato salina (PBS, controle negativo), acetato de forbol miristato (PMA 500 ng/mL, controle positivo), LAAO ou LAAO inativada por calor (50 µg/mL). Após a lise e a ultracentrifugação para separação das frações citosólica e de membrana, separação por SDS-PAGE e ensaios de Western blot , foi realizada a expressão proteica dos componentes da NADPH oxidase e da proteína cinase C- α (PKC- α ) e de sua forma fosforilada (p-PKC- α / β II). Para determinação da produção de EROs foi realizado a quantificação por citometria de fluxo utilizando o fluoróforo 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFDA). Os resultados mostraram que houve expressão de p40 phox , p47 phox , p67 phox e Rac nas frações de membrana, demonstrando a migração dos componentes citosólicos, evento que ocorre quando o complexo é ativado. O Western blot para as proteínas de membrana (gp91 phox e p22 phox ) mostrou reatividade para as condições testadas na fração de membrana. A ativação da NADPH oxidase se dá pela via da PKC, pois houve expressão da proteína fosforilada. A dosagem de EROs mostrou que a LAAO induziu 84,5% das células a produzirem EROs, PMA induziu 90,6%, e o controle negativo 28,5%. Os dados obtidos permitem concluir que a LAAO enzimaticamente ativa foi capaz de ativar o complexo NADPH oxidase de neutrófilos humanos para produção de EROs com a participação da PKC- α . |