MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO DE NEUTRÓFILOS HUMANOS INDUZIDOS PELA L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE Calloselasma rhodostoma
MAURO VALENTINO PALOSCHI 1,2, CHARLES NUNES BOENO1,2, JÉSSICA AMARAL LOPES1,2, ANDRÉ EDUARDO DOS SANTOS DA ROSA1,2, WEVERSON LUCIANO PIRES1,2, SULAMITA DA SILVA SETÚBAL1,2, ADRIANA SILVA PONTES1,2, ANDREIMAR MARTINS SOARES1,2, JULIANA PAVAN ZULIANI1,2
1. FIOCRUZ-RO - Laboratório de Imunologia Celular Aplicada a Sáude – Fundação Oswaldo Cruz de Rondônia, 2. PGBIOEXP/UNIR - Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental – Universidade Federal de Rondônia, 3. CEBIO/FIOCRUZ-RO - Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde – Fundação Oswaldo Cruz de Rondônia, 4. UNIR - Departamento de Medicina/Universidade Federal de Rondônia
paloschimauro@gmail.com

Os venenos de serpentes são constituídos principalmente por proteínas e peptídeos, tornando essas moléculas interessantes para a pesquisa de toxinas animais na ciência biomédica. Dentre esses componentes, as proteínas L-aminoácido oxidases (LAAOs) possuem atividades antimicrobianas em bactérias, fungos, vírus e parasitas, induzem edema, possuem efeitos citotóxicos, coagulantes e anticoagulantes, hemorrágicos e ativam neutrófilos. Ao entrar em contato com o patógeno, o neutrófilo realiza a fagocitose e libera espécies reativas do oxigênio (EROs) via ativação do complexo da NADPH oxidase associado à ativação da PKC. O complexo da NADPH oxidase é composto por proteínas citosólicas (p40 phox , p47 phox e p67 phox ), proteínas de membrana (p22 phox e gp91 phox ) e por uma proteína de sinalização (Rac). O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da LAAO de Calloselasma rhodostoma sobre a ativação do complexo da NADPH oxidase de neutrófilos humanos. Os neutrófilos isolados foram incubados com tampão-fosfato salina (PBS, controle negativo), acetato de forbol miristato (PMA 500 ng/mL, controle positivo), LAAO ou LAAO inativada por calor (50 µg/mL). Após a lise e a ultracentrifugação para separação das frações citosólica e de membrana, separação por SDS-PAGE e ensaios de Western blot , foi realizada a expressão proteica dos componentes da NADPH oxidase e da proteína cinase C- α (PKC- α ) e de sua forma fosforilada (p-PKC- α / β II). Para determinação da produção de EROs foi realizado a quantificação por citometria de fluxo utilizando o fluoróforo 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFDA). Os resultados mostraram que houve expressão de p40 phox , p47 phox , p67 phox e Rac nas frações de membrana, demonstrando a migração dos componentes citosólicos, evento que ocorre quando o complexo é ativado. O Western blot para as proteínas de membrana (gp91 phox e p22 phox ) mostrou reatividade para as condições testadas na fração de membrana. A ativação da NADPH oxidase se dá pela via da PKC, pois houve expressão da proteína fosforilada. A dosagem de EROs mostrou que a LAAO induziu 84,5% das células a produzirem EROs, PMA induziu 90,6%, e o controle negativo 28,5%. Os dados obtidos permitem concluir que a LAAO enzimaticamente ativa foi capaz de ativar o complexo NADPH oxidase de neutrófilos humanos para produção de EROs com a participação da PKC- α .



Palavras-chaves:  L-aminoácido oxidase, NADPH oxidase, Neutrófilos, Calloselasma rhodostoma