ELISA QUIMIOLUMINESCENTE COM PROTEÍNAS MULTIEPITOPOS NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
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Atualmente, as leishmanioses encontram-se entre as principais endemias do mundo. A leishmaniose visceral (LV), causada pelos parasitos do gênero Leishmania, é a forma mais grave da doença. Os cães são considerados os principais reservatórios e a identificação precoce desses animais torna-se importante para limitar sua exposição ao vetor. Métodos sorológicos têm sido as ferramentas mais aplicáveis no diagnóstico da LV canina, tanto pela facilidade de execução, quanto por seu custo acessível. Com o intuito de desenvolver uma metodologia mais eficiente para o diagnóstico da LV canina, realizamos a otimização de um ensaio imunoenzimático (ELISA) convencional reduzindo o tempo de incubação com os anticorpos primário e secundário, modificando o substrato e a forma de leitura da reação, tornando-o um ELISA quimioluminescente (CL ELISA). Como antígeno, avaliamos duas proteínas recombinantes multiepitopos, PQ10 e PQ20, já descritas pelo nosso grupo e consideradas bons antígenos na detecção da infecção canina. Para o CL ELISA, foram utilizados soros caninos testados por RIFI e ELISA com antígeno bruto para LV sabidamente positivos (n=100) e negativos (n=30). A quantificação da quimioluminescência foi feita em aparelho ImageQuant LAS 500, utilizando o substrato ECL, que não apresenta o risco ocupacional característico do revelador OPD, utilizado no ELISA convencional. Para a discriminação dos resultados empregou-se como cut-off a curva ROC, avaliando os melhores valores de sensibilidade e especificidade para cada ensaio. Além desses, a variabilidade e reprodutibilidade foram analisadas. O CL ELISA apresentou excelente desempenho, com valores de acurácia superiores a 0.95, para ambas as proteínas, sendo a especificidade para PQ10 e PQ20 de 83.3% e 90% e a sensibilidade 92.5% e 91.5%, respectivamente. Comparativamente ao ELISA convencional, realizado com as mesmas proteínas multiepitopos, a nova metodologia proporcionou melhora em todos os parâmetros, principalmente na acurácia, que anteriormente apresentava valor médio de 0.84. A variabilidade média apresentada entre lotes de placas e operadores foi menor do que 5% e 15%, respectivamente. A reprodutibilidade do teste para PQ10 e PQ20 apresentou bom coeficiente de correlação quantitativa (r 2 >0.979). Diante dos resultados, consideramos o CL ELISA um método diagnóstico bastante promissor para LV canina, de fácil interpretação, capaz de detectar um grande número de amostras de maneira rápida, eficiente e pouco onerosa. |