AVALIAÇÃO DE REATIVIDADE CRUZADA ENTRE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CITOCINAS HUMANAS E CITOCINAS CANINAS EM CITOMETRIA DE FLUXO |
Respostas imunológicas desenvolvidas por cães são extremamente importantes para estudar resistência ou suscetibilidade a doenças, tais como leishmaniose e doença de Chagas, bem como ensaios de imunizações. A Citometria de Fluxo (CF) é uma poderosa ferramenta com alta capacidade analítica, capaz de indicar com precisão vários parâmetros celulares. No entanto, a disponibilidade de anticorpos conjugados para cães é comercialmente restrita e onerosa, principalmente para a marcação intracelular de citocinas. O objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação da reatividade cruzada entre anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas (AcM) e citocinas de cães para ensaios de CF. Como metodologia, sangue heparinizado de humanos e cães foi aliquotado e cultivado em meio RPMI durante 24h com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) a 5µg/mL e sem estímulo (SE). Como experimento preliminar, a imunofenotipagem para a marcação intracitoplasmática de leucócitos provenientes de um humano e um cão foi realizada com os seguintes AcM conjugados: anti-IL-4, IL-10, TNF e IFN-γ. Após a verificação dos ratios dos percentuais de marcação (%humano/%cão ~ 1), os anticorpos com reações cruzadas sugestivas foram avaliados a partir dos leucócitos de três humanos e três cães, seguindo as mesmas condições de cultivo e marcação. Diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando valores de p≤0,05. Os experimentos foram realizados no citômetro de fluxo FACSCalibur TM e analisados pelo software FlowJo ® . Nossos resultados mostram que uma reação cruzada sugestiva foi obtida com as seguintes citocinas pró- e anti-inflamatórias ( ratios PHA e SE): TNF (0,4 e 1,1), IL-4 (0,38 e 5,0) e IL-10 (0,85 e 0,44). Na análise seguinte, ainda que não tenham ocorrido diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05) entre PHA e SE (tanto no grupo de cães quanto no de humanos), houve um aumento, para os três anticorpos, da marcação das citocinas advindas das amostras que receberam o mitógeno. Adicionalmente, as médias dos percentuais de marcação mostraram-se similares entre cães e humanos, para os três AcM anti-citocinas. Como conclusões, ainda que análises adicionais sejam necessárias, por exemplo, por microscopia confocal para detectar possíveis reações inespecíficas, estes resultados já indicam a possibilidade de uso desses AcM, e consequentemente menos restrições para o desenvolvimento de pesquisas em imunologia/vacinologia para cães, usando a CF. |