NOCAUTE DA TCNTPDASE-1 ALTERA PROCESSOS DE INTERAÇÃO PARASITA-HOSPEDEIRO IN VITRO |
As Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolases (NTPDases) são enzimas que hidrolisam uma ampla gama de nucleotídeos tri- e difosfatados. Estudos prévios apontam a participação destas nos processos de infectividade, virulência e aquisição de purinas por Trypanosoma cruzi . Neste trabalho, desenvolvemos e avaliamos a viabilidade do parasita recombinante (hemi-nocaute) para o gene TcNTPDase-1, a fim de compreender o papel desta enzima, na interação in vitro , destes parasitos com as células do hospedeiro. Para isso, as regiões intergênicas upstream e downstream do gene TcNTPDase-1 foram amplificadas por PCR, ligadas nos respectivos vetores para nocaute pNEO2 e pHYG2 e transfectadas em epimastigotas de T.cruzi (clone Dm28c). Assim, clones dos parasitos recombinantes foram selecionados e cultivados a 28°C em meio LIT, suplementado com 10% de SFB. A extração do RNA foi feita utilizando o reagente TRIzol®, seguido pela quantificação e tratamento com DNAse e síntese do cDNA. Os ensaios de RT-qPCR foram realizados utilizando TcGAPDH e TcCalmodulina como genes de referência. Para os ensaios de western blotting, as proteínas foram extraídas utilizando o método de congelamento e descongelamento e, para revelação das bandas, foi utilizado o soro anti-apirase de batata. As interações in vitro dos parasitos recombinantes com as células VERO foram realizadas em 2 ou 48h a 37°C. Observamos que as formas epimastigotas e tripomastigotas dos hemi-nocaute, resistentes a Higromicina e Neomicina, apresentaram menor expressão da TcNTPDase-1, tanto a nível de mRNA quanto a nível de proteína, quando comparados ao clone selvagem. Além disso, os ensaios de infecção in vitro em células VERO, utilizando os parasitas recombinantes, mostraram uma significante redução nos índices de adesão e endocítico. Em contrapartida, quando T.cruzi foi nocauteado em ambos os alelos do gene NTPDase-1 simultaneamente, não foi possível observar sobrevivência do parasito. No entanto, os parasitos hemi-nocaute são viáveis e apresentam níveis de expressão e interação com células VERO alterados. Esses resultados sugerem um papel desta enzima nos processos de adesão e internalização do parasita as células do hospedeiro. |